Advanced Materials : 肺癌に対する抗腫瘍活性を増強する新たな二重特異性抗体の構築

肺がんに対する抗腫瘍活性を増強する新たな二重特異性抗体の構築

Wei Yin, Junjie Zhu, Diego Gonzalez-Rivas, Meinoshin Okumura, Gaetano Rocco,Harvey Pass, Gening Jiang, and Yang Yang*

HER2およびVEGFは、複数の腫瘍の進行と密接に関連している。これら2種類のタンパク質を同時に標的とする阻害薬は、腫瘍の進行を効果的に阻害する。そこで、YY0411と呼ばれる二重特異性抗体がHER2とVEGFの両方を標的とする強力な抗癌治療抗体として報告されている。YY0411は、IgG-Decoy受容体形式で構築された初めての二重特異性抗体である。これは、HER2およびVEGFタンパク質の両者を効率的に同定し、結合する。YY0411は、ヒト癌細胞(Calu-3、MDA-MB-453、およびNCI-N87細胞)のコロニー形成能力を有意に阻害するため、腫瘍抑制因子の候補であると考えられている。HER2およびVEGFの下流成分のリン酸化は、YY0411の治療により腫瘍細胞の中で減少する。他の抗体と同様に、YY0411は、Tリンパ球によるIFN-γの分泌を促進する能力を有する。さらに、YY0411は、ヌードマウスにおけるCalu-3細胞誘導異種移植片の増殖を有意に阻害する。本研究はYY0411が潜在的な抗肺癌薬となる可能性があることを実証している。

 肺癌によって引き起こされる癌の負担は急速に拡大している。診断や治療は高度な進歩を遂げている一方で、肺癌は依然として世界中の癌による死亡の主要な原因である。[1a,b,2a] 切除術は初期段階の患者にとって最良の選択肢であるが、そのうちの一部は再発のリスクがある。 [2b,c,3a] 進行期の病変を有する患者に適用される化学療法は、薬剤耐性および副作用によって制限を受ける。[2d,e] したがって、有効な治療薬の開発が急務となっている。
 タバコ規制措置の施行に伴い、喫煙に起因する肺癌は減少している。生物学的研究によると、細胞シグナル伝達経路の調節不全が肺癌の主な原因となっている。[4,5] 抗肺癌薬の研究開発の焦点は、異常なシグナル伝達経路の重要な要素を標的とする内容へとシフトしている。免疫細胞によって認識され得る重要なシグナル伝達経路における腫瘍関連抗原(TAA)は、治療における潜在的な標的を提供する。[2f,g] 多数のモノクローナル抗体が商用として承認されている。モノクローナル抗体は癌に対して高い特異性阻害効果を発揮する一方で、[2h,i] オフターゲットのような欠陥は無視できない。二重特異性抗体(BsAb)は、2種類の特異的抗原結合部位を有する組換え抗体である。同時に異なる抗原に結合することができるため、癌細胞との結合特異性が増強される。モノクローナル抗体と比較して、二重特異性抗体はより高い治療効果を有する。現在、European Medicines Agency(EMA)およびFDA(Food and Drug Administration)の承認を受けているのはCatumaxomab(Trion Pharma)およびBlinatumomab(Amgen lnc)の2つの二重特異性抗体である。CatumaxomabはCD3および上皮細胞接着分子(EPCAM)の両者を標的とし、AmgenはCD19およびCD13を標的とする。

Dr. W. Yin
Key laboratory of Oral Biomedical engineering of Ministry of education Hospital of Stomatology
School of Stomatology Wuhan University Wuhan 430079, China
J. Zhu, Dr. D. Gonzalez-Rivas, Prof. G. Jiang, Dr. Y. Yang Department of Thoracic Surgery
Shanghai Pulmonary Hospital
507 Zhengmin Road, Shanghai 200433, China E-mail: timyangsh@tongji.edu.cn
Dr. D. Gonzalez-Rivas
Department of thoracic surgery and Minimally Invasive Thoracic Surgery Unit (UCTMI).
Coruña University Hospital, Coruña 15706, Spain

Prof. M. Okumura Hospital Director
Toneyama National Hospital Osaka 560-8552, Japan
Prof. G. Rocco Thoracic Service Department of Surgery
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center NY 10065, USA
Prof. H. Pass
Department of Cardiothoracic Surgery NYU Langone Medical Center
NY 10016, USA
Dr. Y. Yang
Institute for Advanced Study Tongji University
1239 Siping Road, Shanghai 200430, China


 より強力な抗がん剤を開発するために、我々は、同済大学上海呼吸器科病院胸部外科部の肺癌患者の遺伝子発現様式を分析した。我々のデータによると、29.8%の肺癌患者においてHER2の過剰発現が検出され、60.1%の肺癌患者(未発表データ)においてVEGFが発現されたことが示唆された。HER2の過剰発現は、乳癌、卵巣癌および肺癌の進行と密接に関連していることがよく知られている。[2j–l] HER2の発現性が高い癌では、転移性および侵襲性の強い能力を有するが、HER2過剰発現癌の化学療法に対する感受性は低い。VEGFは、癌の進行および転移において非常に重要な血管新生刺激因子である。[3b] それは肺癌および他の癌において陽性として発現する。[2m] VEGFを標的とした癌血管新生阻害剤は、血管新生を効率的に阻害し、癌の栄養供給を遮断し、癌の進行および転移を制限することができる。[2n] したがって、我々はHER2およびVEGFの両者を標的とする二重特異性抗体を構築することを目的とした。
 HER2モノクローナル抗体およびVEGFモノクローナル抗体が長年にわたり臨床で使用されていることを考慮し、我々はまず入手可能なHER2およびVEGFのモノクローナル抗体配列をそれぞれ合成した。我々は、それらを免疫グロブリン(IgG)様式または一本鎖抗体形態(scFv)の中間体として調製した。しかし、これらは全て一過性発現および抗体結合試験をパスすることはできなかった。詳細には、哺乳動物細胞に一過性にトランスフェクトした後、HER2抗体のscFv型の認識能力は2倍から5倍減少した。さらに、精製透析中にタンパク質沈殿が起こった。
 scFV形態のVEGF抗体を含む二重特異性抗体は発現されなかった。重鎖と軽鎖の順序が入れ替わっても発現の問題は改善されなかった。したがって、scFVの形態の二重特異性抗体は欠損していた。我々は複数の方法を試し続けたが、満足のいく結果は得られなかった。

図1. HER2およびVEGF二重特異性抗体(YY0411)の同時標的の構造。YY0411はIgG-DR形態の抗体である。軽鎖および重鎖は、可撓性ライゲーション短ペプチドによって結合された。

図2. a) YY0411はHER2を効率的に認識する。 b)YY0411はVEGFを効率的に認識する。 c、d)YY0411は、ヒトHER2またはVEGFとの高い親和性を示す。 e、f)YY0411は、ヒトHER2およびVEGFとの高い親和性を示す。

 血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)は、VEGFに特異的に結合する高親和性受容体であり、VEGF誘発血管形成の促進において重要な役割を果たす。したがって我々は、VEGFRを標的にしてVEGFシグナルを遮断できるか否かを検討した。デコイ受容体とは、機能的受容体と同様の構造を共有する特殊な受容体を指す。その細胞質領域は必要な領域を欠いているため、シグナル伝達能力を持たないリガンドに結合する。それはリガンドに競合的に結合することによって機能的受容体をネガティブに調節する。我々はVEGFRを合成し、それをHER2のIgG型に連結した(図1)。その一過性発現レベルは200 mg L-1まで増加したが、それは抗体のscFv型よりも有意に良好な結果であった。さらに、90%以上の精製がプロテインA親和―クロマトグラフィーによって達成された。したがって、二重特異性抗体のC末端がVEGFRである場合、発現および精製に有利であった。ウエスタンブロッティング分析により、我々がYY0411と名付けた二重特異性抗体が、HER2およびVEGFタンパク質の両方を効率的に同定することを確認した(図2a、b)。上記の結果により、YY0411は、HER2およびVEGFの両方を標的とする初めての二重特異性抗体であると結論づけた。それはIgG-デコイ受容体(IgG-DR)構造抗体であった。VEGFに結合する能力を有するVEGFレセプター配列を、可撓性ライゲーション短鎖ペプチド(GGGGS)4によってHER2抗体のIgG型と連結した。グリシン(G)は、分子量が最も小さく、側鎖が最も短いアミノ酸であり、可撓性を高めることができる。セリン(S)は最も親水性の高いアミノ酸である。3D構造解析では、HER2とVEGFRとの融合タンパク質が独立したままであり、その生物学的活性が維持されることを示した(図1)。
 候補となる二重特異性分子を構築した後、YY0411のHER2およびVEGFとの結合能力を調べた。まず、YY0411が単一の標的に結合する能力を分析した。図2c、dに示すように、YY0411は市販のHER2またはVEGFモノクローナル抗体と類似した標的結合能力を有していた。次に、HER2とVEGFの両者に結合する能力を分析した。YY0411のみが用量依存的に両者の標的を認識した(図2e、f)。したがって、YY0411は市販のHER2やVEGFモノクローナル抗体よりもHER2、VEGF、HER2-VEGFおよびVEGF-HER2との結合において優れていると我々は結論づけた。
 YY0411の結合能力を同定した後、我々はHER2陽性癌細胞のコロニー形成能力に対する効果をさらに分析した。図3aに示すように、市販のHER2およびVEGFモノクローナル抗体を組み合わせて用いた場合と比較して、YY0411はヒト癌細胞(Calu-3、MDA-MB-453およびNCI-N87細胞)のコロニー形成を有意に阻害した。
 腫瘍進行に対するYY0411の役割を正確に明らかにするため、YY0411がインビボでのCalu-3細胞誘導性異種移植の増殖に及ぼす影響を観察した。異種移植片の腫瘍体積が200mm3に達したとき、抗体(YY0411、市販のHER2抗体、市販のVEGF抗体、および市販のHER2 + VEGF抗体)を3日毎に腹腔内注射で投与した。図3bに示すように、YY0411、HER2抗体、およびVEGF抗体は全て腫瘍増殖を阻害したが、YY0411が最も顕著な腫瘍阻害剤であった。 YY0411の投与を受けた異種移植片は、最も容積が小さかった。

図3. a) YY0411はヒトNCI-N87、Calu-3およびMDA-MB-453癌細胞のコロニー形成能力を有意に阻害する。 YY0411群とHER2およびVEGFモノクローナル抗体の同時使用との間で有意差が観察される(* P <0.05)。b)YY0411は、生体内でCalu-3細胞の腫瘍形成能を低下させる。YY0411群と他の群との間で有意差が観察される(* P <0.05)。

図4. a) YY0411はHER2およびVEGF媒介シグナル伝達経路の活性化を阻害する。 b)YY0411はヒトTリンパ球の分泌を促進する(* P <0.05)。

 その抗腫瘍効果を観察した後、我々はさらにこの効果の根底にある分子メカニズムを分析した。我々は、HER2およびVEGFの下流分子の活性化を検出した。HUVEC細胞では、VEGFR2のリン酸化はYY0411によって強く阻害されたが、Calu-3細胞では、YY0411を用いることでAKTの活性が減少した(図4a)。HER2およびVEGF下流分子に対するYY0411の阻害能力は、2つのモノクローナル抗体を単独または組み合わせて使用した場合と比較して、有意に強力であった。抗体が宿主免疫細胞を刺激・活性化する傾向があることを踏まえ、YY0411の適用の有無によるTリンパ球によるIFN-γ分泌量の差も調べた。我々の結果は、YY0411がTリンパ球をIFN-γの分泌を促進することを確認した(図4b)。IFN-γは、一部の腫瘍の発達および進行を阻害する上で重要な役割を果たす。したがって、我々は、本研究の結果が、YY0411が腫瘍を阻害する能力が包括的のものであることを実証したと考えた。
 要約すると、我々は、HER2およびVEGFの両者を標的とするはじめての二重特異性抗体を構築することに成功した。YY0411は、初期および進行期段階の癌を有する患者の両方に適用可能であった。近年のナノ材料の発展を考慮すると[6a,b]早期病変を有する患者では、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)および切除後新鮮癌組織でのタンパク質測定によってHER2およびVEGFの遺伝子型および発現レベルを決定した後、HER2過剰発現およびVEGF発現を有する患者は、YY0411の適応による恩恵を受けるであろう。さらに、進行病期の病変を有する患者では、YY0411は、HER2およびVEGFの両者を遮断し、病変の進行を阻害することによって生存率を改善する可能性がある。

実験

 二重特異性抗体の作製: ヒトHER2およびVEGFRの軽鎖および重鎖をコーディングするDNA断片を合成した後、これらのDNA断片をpcDNA3.1発現ベクターにクローニングした。軽鎖および重鎖DNA(質量比= 2:1)を、リン酸カルシウムトランスフェクションによってHEK293T細胞にトランスフェクトした。候補となる二重特異性分子を、アフィニティークロマトグラフィーゲルカラム(タンパク質A)を用いて培地の上清から精製した。分子の三次元構造をGENO3D(https://geno3d-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/geno3d_ automat.pl?page=/GENO3D/geno3d_home.html)で分析した。HER2およびVEGFを認識する候補となる二重特異性分子の能力を、MDA-MB-453およびHUVEC細胞におけるウエスタンブロッティング分析によって同定した。
 HER2およびVEGFに対する結合親和性: ELISA分析を使用して、候補となる二重特異性分子のHER2およびVEGFとの結合親和性を比較した。ヒト組換えHER2および/またはVEGFを96ウェルプレートに4℃にて20時間コーティングした。次にそれを37℃にて2時間PBS(1%ウシ血清アルブミン、BSAを含む)で遮蔽し、PBS-Tで洗浄した。プレートを、YY0411、市販のHER2、市販のVEGF、または市販のHER2 + VEGF抗体のいずれかと共に37℃で2時間培養し、続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgG Fab抗体を培養した。3,3¢,5,5¢テトラメチルベンジジン(TMB)基質試薬との培養後、450nmでの吸光度を検出することによって結合親和性を測定した。
 細胞増殖分析: HUVEC、Calu-3、MDA-MB-453、およびNCI-N87細胞を96ウェルプレートで20時間培養した。次いで、候補となる二重特異性分子および市販のHER2および/またはVEGF抗体を培地に添加した。細胞増殖は、推奨プロトコルに従って4日目にCKK8分析によって決定した。
 HER2およびVEGFシグナル伝達経路の活性: HUVECおよびCalu-3細胞を6ウェルプレートで20時間培養した。次いで、候補となる二重特異性分子および市販のHER2および/またはVEGF抗体を培地に添加した。組換えヒトVEGFでHUVEC細胞を刺激した。Calu-3細胞を組換えヒトHER2で刺激した。細胞を溶解緩衝液中で溶解し、ウエスタンブロッティングを用いてVEGFR2およびAKTのリン酸化を分析した。
 IFN-γ発現分析: Tリンパ球懸濁液を、37℃で72時間、候補となる二重特異性分子有り、無しの条件で培養した。IFN-γの濃度はELISAキットを用いて測定した。
 異種移植モデル: 8週齢の胸腺欠損免疫不全Balb/cヌードマウスを用いて、Calu-3細胞誘導性腫瘍の進行に対するYY0411の効果を分析した。Calu-3細胞(1’107)細胞を皮下注射した。
 抗体 (YY0411, 2 mg kg-1), 市販のHER2抗体(製造業者の推奨に準拠)、市販のVEGF抗体(製造業者の推奨に準拠)、および市販のHER2 + VEGF抗体)を腫瘍容積が200mm3に達したときに腹腔内注射により3日間毎に投与した。腫瘍体積を毎日連続して記録した。標本は注射後21日目に採取した。
 統計処理: マウス異種移植片の腫瘍体積を二元配置分散分析によって分析した。一元配置分散分析を用いて、細胞生存率アッセイ、細胞浸潤アッセイ、およびコロニー形成アッセイの結果を分析した。全てのデータはWindows用SPSSパッケージ(18.0版、シカゴ、イリノイ州)を用いて分析した。統計的有意水準はp<0.05とした。

謝辞

  本研究は、中国国立自然科学基金 (81602412; 51872205; 81501750)、中央大学の基礎研究基金、優秀医療人材養成計画、上海市保健・家庭計画委員会(2017YQ050)、上海市保健・家庭計画委員会科学研究プロジェクト(2016Y0121)、ナチュラ上海科学財団 (134119b1002)、上海呼吸器科病院における優秀若手科学研究者、湖北省自然科学財団 (2018002971272)、および武漢市若手および中堅優秀医療人材の助成を受けている。すべての動物実験は上海呼吸器科病院の施設審査委員会(Institutional Review Board:IRB)による承認を受け、動物実験のすべてのプロトコルは実験動物の管理・使用ガイドラインに準拠している。

利益相反

Y.Y.およびW.Y.は、本論文で議論された知見に関する2つの特許(201810721654.1と15854645)の発明者である

キーワード

二重特異性抗体、HER2、IgG-Decoy受容体、肺癌、VEGF

受付: 2018年8月20日
修正: 2018年9月11日
オンライン出版:


[1] a) S. Zhang, C. Sun, J. Zeng, Q. Sun, G. Wang, Y. Wang, Y. Wu, S. Dou, M. Gao, Z. Li, Adv. Mater. 2016, 28, 8927;
      b) C. Liu, Z. Gao,J. Zeng, Y. Hou, F. Fang, Y. Li, R. Qiao, L. Shen, H. Lei, W. Yang, M. Gao, ACS Nano 2013, 7, 7227.
[2] a) R. L. Siegel, K. D. Miller, A. Jemal, Ca-Cancer J. Clin. 2017, 67, 7;
      b) B. J. Schneider, M. E. Daly, E. B. Kennedy, M. B. Antonoff, S. Broderick, J. Feldman, S. Jolly, B. Meyers,
          G. Rocco, C. Rusthoven, B. J. Slotman, D. H. Sterman, B. M. Stiles, J. Clin. Oncol. 2018, 36, 710;
      c) P. R. Bucciarelli, K. S. Tan, N. P. Chudgar, W. Brandt, J. Montecalvo, T. Eguchi, Y. Liu, R. Aly, W. D. Travis,
          P. S. Adusumilli, D. R. Jones, J. Thorac. Oncol. 2018, 13, 73;
      d) B. Han, S. Tjulandin, K. Hagiwara, N. Normanno, L. Wulandari, K. Laktionov, A. Hudoyo,
          Y. He, Y. P. Zhang, M. Z. Wang, C. Y. Liu, M. Ratcliffe, R. McCormack, M. Reck, Lung Cancer 2017, 113, 37;
      e) T. Talbot, A. Dangoor, R. Shah, J. Naik, D. Talbot, J. F. Lester, R. Cipelli, M. Hodgson, A. Patel, M. Summerhayes,
        T. Newsom-Davis, Lung Cancer 2017, 113, 115;
      f) V. Kochin, T. Kanaseki, S. Tokita, S. Miyamoto, Y. Shionoya, Y. Kikuchi, D. Morooka, Y. Hirohashi, T. Tsukahara,
          K. Watanabe, S. Toji, Y. Kokai, N. Sato, T. Torigoe, OncoImmunology 2017, 6, e1293214;
      g) J. M. Lee, M. H. Lee, E. Garon, J. W. Goldman, R. Salehi-Rad, F. E. Baratelli, D. Schaue, G. Wang, F. Rosen,
          J. Yanagawa, T. C. Walser, Y. Lin, S. J. Park, S. Adams, F. M. Marincola, P. C. Tumeh, F. Abtin, R. Suh,
          K. L. Reckamp, G. Lee, W. D. Wallace, S. Lee, G. Zeng, D. A. Elashoff, S. Sharma, S. M. Dubinett,  Clin. Cancer Res. 2017, 23, 4556;
      h) M. Liu, L. Q. Xing, Oncol. Lett. 2017, 14, 1561;
      i) P. A. Ott, E. Elez, S. Hiret, D. W. Kim, A. Morosky, S. Saraf, B. Piperdi, J. M. Mehnert, J. Clin. Oncol. 2017, 35, 3823;
      j) A. E. Brinker, C. J. Vivian, D. C. Koestler, T. T. Tsue, R. A. Jensen, D. R. Welch, Cancer Res. 2017, 77, 6941;
      k) H. Pan, R. Gray, J. Braybrooke, C. Davies, C. Taylor, P. McGale, R. Peto, K. I. Pritchard, J. Bergh, M. Dowsett,
          D. F. Hayes, EBCTCG, N. Engl. J. Med. 2017, 377, 1836;
      l) G. Curigliano, H. J. Burstein, P E. Winer, M. Gnant, P. Dubsky, S. Loibl, M. Colleoni, M. M. Regan,
          Piccart-M. Gebhart, H. J. Senn, B. Thürlimann, St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2017,
          F. André, J. Baselga, J. Bergh, H. Bonnefoi, Y. S. Brucker, F. Cardoso, L. Carey, E. Ciruelos, J. Cuzick, C. Denkert, Di A. Leo, B. Ejlertsen,
          P. Francis, V. Galimberti, J. Garber, B. Gulluoglu, P. Goodwin, N. Harbeck, D. F. Hayes, C. S. Huang, J. Huober, K. Hussein, J. Jassem,
          Z. Jiang, P. Karlsson, M. Morrow, R. Orecchia, K. C. Osborne, O. Pagani, A. H. Partridge, K. Pritchard, J. Ro, E. J. T. Rutgers, F. Sedlmayer,
          V. Semiglazov, Z. Shao, I. Smith, M. Toi, A. Tutt, G. Viale, T. Watanabe, T. J. Whelan, B. Xu, Ann. Oncol. 2017, 28, 1700;
      m) M. Hassanshahi, A. Hassanshahi, S. Khabbazi, Y. W. Su, C. J. Xian, Angiogenesis 2017, 20, 427;
      n) V. Subbiah, C. Meyer, R. Zinner, F. Meric-Bernstam, M. L. Zahurak, A. O’Connor, J. Roszik, K. Shaw, J. A. Ludwig, R. Kurzrock, N. A. Azad, Clin. Cancer Res. 2017, 23, 4027.
[3] a) A. Salem, M. C. Asselin, B. Reymen, A. Jackson, P. Lambin, C. M. L. West, J. B. P. O’Connor, C. Faivre-Finn, J. Natl. Cancer Inst. 2018, 110, 14;
      b) S. Sajib, F. T. Zahra, M. S. Lionakis, N. A. German, C. M. Mikelis, Angiogenesis 2018, 21, 1.
[4] D. Hanahan, R. A. Weinberg, Cell 2011, 144, 646.
[5] S. Ekman, M. W. Wynes, F. R. Hirsch, J. Thorac. Oncol. 2012, 7, 947.
[6] a) L. Chen, J. Chen, S. Qiu, L. Wen, Y. Wu, Y. Hou, Y. Wang, J. Zeng, Y. Feng, Z. Li, H. Shan, M. Gao, Small 2018, 14, 1702700;
      b) T. Ma, Y. Hou, J. Zeng, C. Liu, P. Zhang, L. Jing, D. Shangguan, M. Gao, J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 211. i) P. A. Ott, E. Elez,

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